Western Blotting服务|实验技术服务

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Western Blotting服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
免疫蛋白质印迹(Western blotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。宝赛生物为您提供全套的常规免疫印记技术服务，同时本公司采用先进的LICOR Odyssey双色红外激光成像系统和双色荧光染料标记的二抗*新推出高灵敏度的红外激光免疫印迹服务。与常规化学发光方法比较，灵敏度可达到皮克级（pg），还具有双色成像、定量**、成像清晰的优点。同时具备功能强大的软件系统，可快速判定样品分子量大小并进行定量分析。
1.样品收集
1）培养的细胞
贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。
2）动物组织
与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。
2．样品定量
样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种，其灵敏度和所需时间不同，且不同的方**受不同干扰物质的影响，实验者可根据样品制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择。
注意事项：
a. 应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白（如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等）及其他干扰物质；
b. 样品浓度应适中，1×SDS凝胶加样缓冲液建议用量：贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml，悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入；
c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要，浓度应控制在2-10%之间，并根据具体需要调整；
d. 制备好的样品可以在-20℃保存，但时间不宜过长，并避免反复冻融，否则蛋白会发生降解；
e. 内参对实验结果至关重要，应选择合适的内参。
Western印迹含一系列步骤，包括：
􀁺 用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。
􀁺 将胶上的蛋白转移到膜上。
􀁺 鉴定膜上特定蛋白。
主要实验步骤如下：
1. 蛋白质抽提
2. 蛋白质定量
3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)
4. 蛋白质转移到硝酸纤维膜；
5. 膜的封闭和一抗抗体孵育；
6. Rockland荧光标记二抗孵育
7. LICOR Odyssey双色红外激光成像系统扫描
8. Odyssey软件数据分析
9. 提供实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关图表